Western blot fejlfinding

Løs dine Western blot-problemer med disse fejlfindingstip, der dækker almindelige årsager til intet signal, høj baggrund, flere bånd og mere.

1. Intet signal
2. Høj baggrund.
3. Flere bånd.
4. Ujævne hvide "pletter" på pletten.
5. Sorte prikker på pletten.
6. Hvide bånd på en sort plet.
7. Molekylvægtmarkørbane er sort.

1. Hvorfor fungerer min Western blot ikke??
2. Hvorfor er min Western blot udtværet??
3. Vaskes efter blokering af Western blot?
4. Hvad forårsager ikke-specifik binding i Western blot?
5. Hvordan kan jeg forbedre mine Western blot-resultater?
6. Hvorfor bruger vi mælk i Western blot?
7. Hvad er trinnene i Western blotting?
8. Kan du overføre en Western blot??
9. Hvordan bekræfter du overførsel af proteinbånd fra gel til membran i Western Blot-protokollen?
10. Hvor længe kan du blokere en Western blot?
11. Kan du blokere et Western blot i weekenden?
12. Hvor mange gange kan du strippe en Western blot??

Hvorfor fungerer min Western blot ikke??

Hvis du har for lidt protein, hvis dit primære antistof ikke har høj affinitet, eller hvis dit primære antistof er i en suboptimal fortynding, kan du ikke se dit protein. Alternativt, hvis du indlæser for meget protein, kan dit signal til støjforhold muligvis gå op og forårsage problemer med visualisering.

Hvorfor er min Western blot udtværet?

Hvad er årsagen til en udstrygning i en western blot? Som du kan se fra ponceau-farvningen af ​​overførslen, er der en udtværing, der går gennem de første 7 baner. Prøverne er embryonale stamceller lyseret med 2xLSB prøvebuffer, pipettering og kogning. ... Tilsyneladende skyldes udstrygningen for mange celler i en brønd.

Vaskes efter blokering af Western blot?

Blokering er et meget vigtigt trin i immundetektionsfasen af ​​Western blotting, fordi det forhindrer ikke-specifik binding af antistof til blottingmembranen. Efter blokering skylles pletten i vaskebuffer, sædvanligvis TBST, med forsigtig omrøring og i tilstrækkelig volumen til at holde pletten nedsænket. ...

Hvad forårsager ikke-specifik binding i Western blot?

En af de mest almindelige årsager til ikke-specifikke bånd er ufuldstændig blokering. Blokerende buffere bruges til at forhindre primære og sekundære antistoffer i at binde til membranen eller noget andet end proteinet af interesse.

Hvordan kan jeg forbedre mine Western blot-resultater?

Opløsning

1. Reducer primær antistofkoncentration.
2. Reducer mængden af ​​totalt protein fyldt på gel.
3. Juster betingelser for membranblokering.
4. Forøg antallet af vaske.
5. Kontroller specificiteten af ​​antistoffet.
6. Blot med det sekundære antistof alene.
7. Hvis der udvikles bånd, skal du vælge et alternativt sekundært antistof.

Hvorfor bruger vi mælk i Western blot?

Blokering er et meget vigtigt trin i western blotting, da det forhindrer antistoffer i at binde sig til membranen ikke specifikt. Blokering foretages ofte med 5% BSA eller fedtfri tørret mælk fortyndet i TBST for at reducere baggrunden. ... Antistoffet kan fortyndes i en vaskebuffer, såsom PBS eller TBST.

Hvad er trinnene i Western blotting?

Fem trin er involveret i western blotting-procedure og påvisningsassay, nemlig overførsel, blokering, primær antistofinkubation, sekundær antistofinkubation og proteinpåvisning og western blotting-analyse.

Kan du overføre et Western blot??

Med stigende tid er der imidlertid en risiko for overoverførsel (stripping, gennemblæsning) af proteinerne gennem membranen, især for lavere molekylvægt (<30 kDa) proteiner, når der anvendes membraner med en større porestørrelse (0,45 µm). Workflow af våd / tankelektrotransfer af protein til western blotting.

Hvordan bekræfter du overførsel af proteinbånd fra gel til membran i Western Blot-protokollen?

Proteinoverførselsprotokol

1. Forbered PVDF-membranen ved at fugte den i methanol i 30 sekunder og derefter blødes den kort i destilleret vand efterfulgt af 1X overføringsbuffer. ...
2. Sug filterpapirer og svampe i overførselsbufferen i 10 minutter inden overføringssandwichen samles.

Hvor længe kan du blokere en Western blot?

Generelt bør maksimal blokeringstid ikke overstige 2 timer ved stuetemperatur, ellers kan proteiner udveksles fra membranen. Fortynd det primære antistof til den anbefalede koncentration / fortynding i frisk blokerende opløsning (TBS og / eller PBS (PBS tabletter 524650-1EA) / 3% fedtfri tør mælk).

Kan du blokere en Western blot i weekenden?

Stærke titerantistoffer fungerer bedst ved en kort inkubation, og svage dækantistoffer kræver længere inkubation (ved højere koncentration). At lade pletten være i den blokerende buffer natten over eller i weekenden ved 4C gør ikke ondt.

Hvor mange gange kan du strippe en Western blot??

også mens vi prøver at fjerne de primære antistoffer, er det et punkt at bemærke, at der er en sandsynlighed for, at du kan miste noget af det protein, du har vedhæftet eller overført på membranen, og det tilrådes derfor ikke at strippe membranen mere end en gang.